為了準確地進行基因表達量分析，必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但Total RNA中常?；煊谢蚪MDNA，并可以直接作為PCR反應的模板進行擴增，因此會造成解析結果不準確。為了避免這種情況發(fā)生，通常將檢測用引物設計在內含子前后的外顯子上，使基因組DNA得不到擴增。但是，此方法不適合具有單個外顯子的基因或兩個外顯子之間所跨的內含子過小的基因，同時當基因組上有偽基因存在時、或設計引物對基因組有非特異性擴增時、以及基因信息沒被 wan quan 解析的生物種等也同樣不適合于本方法。在這種情況下，我們常常需要對Total RNA樣品進行DNase I處理，以除去殘存的基因組DNA。而DNase I處理通常要進行復雜的純化操作，同時會造成RNA的降解和損失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因組DNA進行Real Time RT-PCR反應的專用反轉錄試劑。Kit中使用了具有較強DNA分解活性的gDNA Eraser，通過42℃，2 min即可除去基因組DNA。同時由于反轉錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分，經(jīng)過gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進行15 min的反轉錄反應合成cDNA，因此，20 min內即可迅速完成從基因組DNA去除到cDNA合成的全過程。
使用本制品合成的cDNA適用于嵌合法和探針法qPCR分析，可以根據(jù)實驗目的，選擇與TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)*、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420A/B)*、Probe qPCR Mix (Code No. RR391S/A/B) 組合使用。
*：Takara嵌合法Real Time PCR（qPCR）產品的名稱從2017年12月下旬開始，將逐步變更為「TB Green系列」。產品Code、性能和原有產品相比沒有變化，請繼續(xù)放心使用。
2. 只需15 min即可高效合成Real Time PCR反應用模板cDNA，是進行2 Step Real Time RT-PCR反應的理想試劑。
3. 反轉錄引物使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer混合的RT Primer Mix，可以均勻合成樣品中的各種cDNA。
4. 本制品提供了TB Green qPCR分析法和探針qPCR分析法各自適合的反應體系，可以根據(jù)分析方法選擇體系。
TB Green qPCR分析法和探針qPCR分析法區(qū)別如下：
(1) 反轉錄反應中RT Primer Mix的用量。
(2) 反轉錄反應中總RNA的用量。
5. Real Time RT PCR定量需要建立標準曲線，建立標準曲線的條件就是需要將總RNA和反轉錄cDNA稀釋到較低的濃度。如果用水或TE Buffer稀釋時，由于模板濃度低不穩(wěn)定，因而會縮小曲線范圍，結果準確度降低。本制品中附加了標準曲線制作用稀釋液EASY Dilution (for Real Time PCR) ，將Total RNA或cDNA稀釋至低濃度時也能夠進行準確稀釋，容易在寬廣范圍內獲得準確定量的標準曲線。
注意事項
1．使用本制品合成的cDNA與TB Green關聯(lián)制品組合使用時，建議使用：
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No.RR820Q/A/B)
TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR420Q/A/B)
以上制品與本制品組合使用，可以得到可信度高的結果。
本制品與TB Green Fast qPCR Mix (Code No. RR430S/A/B) 組合使用時，有時反應性能不好，不推薦使用。
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